BIOMEDICINA

Estrutura do HIV

Daciana Gama                  0820198
Jane Furtado                    0821145
Suzi Damasceno               0820271

RETROVIRUS:  RETRO(atras ) VÍRUS(agente infeccioso)

Características: Os membros dessa família podem ser destacados por apresentar as seguintes características:

-possuir genoma RNA dupla fita de filamento positivo,

-possuir a enzima transcriptase reversa responsável por sintetizar o DNA a partir do RNA genômico

-ser capaz de integrar seu DNA no genoma da célula hospedeira de forma estável.

Subfamílias:

Os lentivírus(crescimento lento), bem como os oncovírus e os spumavírus, pertencem à família Retroviridae. Essa família possui genoma composto por duas fitas simples de RNA e enzima transcriptase reversa. Os vírus de imunodeficiência humana (HIV), felina (FIV) e simiana (SIV) são os representantes mais bem conhecidos dos lentivírus, devido aos seus efeitos patológicos. O genoma dos lentivírus apresenta uma organização mais complexa do que dos oncovírus e muitos dos seus processos moleculares já estão descritos OU já são conhecidos. Além disso, são capazes de infectar inclusive células quiescentes, características essa que se opõe ao tropismo dos oncovírus.  Essas propriedades levaram ao desenvolvimento de vetores lentivirais para terapia gênica e a perspectiva do emprego terapêutico dos  mesmos na clínica – por exemplo, para síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA). Uma série de modificações de engenharia genética no lentivetor baseado em HIV levou ao desenvolvimento do primeiro protocolo clínico de terapia gênica lentiviral contra a SIDA, nos EUA. Atualmente, existem vários protocolos clínicos com lentivetores em andamento, seguindo a tendência de empregá-los  também em outras doenças.

      Lentivirus (HIV, SIV, e FIV).

Os lentivírus apresentam genoma composto pelos genes estruturais GAG (glycosaminoglycans), POL e ENV, além de genes acessórios e de regulação. Por possuir esses genes adicionais aos estruturais diz-se que o genoma dos lentivírus é complexo. Os lentivírus não possuem ciclo de replicação lítico (processo em que a célula se rompe devido ao numero de virus) e são capazes de infectar células quiescentes. A patogenia associada a esses vírus inclui grande variedade de doenças neurológicas e imunológicas, sendo a SIDA a doença mais estudada. Entre seus representantes mais conhecidos estão: vírus de visna (Visna/Maedi vírus); anemia infecciosa de eqüino (equine infectious anemia vírus - EIAV); artrite encefálica em cabra (caprine arthritis encephalitis vírus - CAEV); imunodeficiências de humanos (human immunodeficiency vírus - HIV), de simios (simian immunodeficiency vírus - SID), de felino (feline immunodeficiency vírus - FIV) e de bovinos (bovine immunodeficiency vírus - BIV)

Spumavírus

Os spumavírus são caracterizados por causarem um efeito citopático vacuolado que conferem aspecto “espumoso” às células. Possuem glicoproteínas de superfície muito distintas dos outros retrovírus, aparência do núcleo imatura e o seu envelope é proveniente do retículo endoplasmático ao invés da membrana plasmática. Esses vírus são causadores de várias doenças em humanos como tireoidismo de Quervain, esclerose múltipla, miastenia grave e outras. Apesar de essa subfamília ser causadora de doenças graves, ela não é extensivamente estuda, porque sua  prevalência em humanos é pequena, quando comparada com outras doenças causadas por outros retrovírus como o HIV.

Oncovírus

Subfamília compreendida pelos vírus que necessitam encontrar a célula hospedeira em divisão para que seu genoma passe pelos poros da membrana nuclear e integre ao DNA da célula hospedeira. Existem várias tipos de oncovírus sendo que o mais conhecido é vírus da leucemia murina de moloney (moloney murine leukemia vírus - MoMLV), bastante utilizado na engenharia de vetores já que seu genoma é o mais simples dentre eles (apenas possuindo genes GAG, POL e ENV). O estudo da oncogênese retroviral abriu todo o campo do controle de crescimento celular. Isso levou à descoberta de proto-oncogenes, genes celulares, cujos produtos funcionam normalmente na transdução de sinais que regulam a replicação celular. Conhecimento atual sobre o controle do crescimento e da diferenciação e do crescimento anormal de câncer tem origem em grande parte das investigações de genes reguladores identificado pela primeira vez em retrovírus altamente oncogênicos. Estudos desses genes têm destacado a importância de discretas mudanças genéticas em transformação maligna. Os Retrovírus também forneceram ferramentas essenciais para a biotecnologia. Transcriptase reversa do retrovírus murino aviária e são utilizadas universalmente para gerar cópias de cDNA de RNA que então podem ser manipulados com relativa facilidade para a clonagem e sequenciamento. Genomas modificados retrovirais são amplamente utilizados na expressão transitória e estável de genes clonados em células de vertebrados. Eles também são promissores veículos de entrega para a terapia genética humana.

O esquema da estrutura "clássica" de um genoma retroviral é: 5' LTR-gag-pol-env-LTR 3'. As regiões LTR ("longo terminal repetido") representam as duas extremidades do genoma viral que estão ligadas ao ADN celular da célula hospedeira após integração e que não codificam para nenhuma proteína viral. Os genes gag e env codificam para a nucleocápside e para as glicoproteinas da membrana viral; o gene pol codifica para a  transcriptase reversa e para outras enzimas. Em adição, o VIH-1 contém no seu ARN de 9kB seis genes (vif, vpu, vpr, tat, rev e nef) que contribuem para a sua complexidade genética. nef, vif, vpr e vpu foram classificados no passado como genes acessórios, e não são absolutamente necessários para a replicação in vitro. No entanto, a regulação e a função destes genes acessórios e das suas proteínas têm sido estudadas e caracterizadas em mais detalhe nos últimos anos. Os genes acessórios, nef, tat e rev, são produzidos precocemente no ciclo de replicação viral.

HIV

HIV 1 E HIV 2

As infecções por Lentivirus mostram tipicamente um curso crônico da doença, um longo período de latência clínica, replicação viral persistente e envolvimento do sistema nervoso central. O HIV 1 e 2 diferem no peso molecular das suas proteínas, e têm diferenças nos seus genes acessórios. O VIH-2 é mais relacionado geneticamente com o SIV encontrado nos sootey mangabeys(SIVsm) do que o VIH-1 que parece ter sido introduzido na população humana por macacos. Tanto o VIH-1 como o VIH-2 replicam-se nas células T CD4⁺ e são patogênicos para os indivíduos infectados apesar da imunodeficiência ser menos severa nos indivíduos infectados por VIH-2.

O envelope viral contém duas glicoproteínas, gp 41 e gp120. O core do HIV é composto de 3 proteínas estruturais a p24, p16 e p9. A proteína p24 forma o capsídeo que encerra duas fitas de RNA e as enzimas virais. O genoma viral apresenta aproximadamente 10.000 nucleotídeos (10 Kb) e é constituído dos genes gag, pol e env. O gene gag codifica as proteínas estruturais do virus, env as glicoproteínas gp120 e gp41, essenciais para que o vírus fixe e ingresse na célula, e pol as enzimas virais da transcriptase reversa (TR), integrase e protease. Dois outros genes essenciais para a replicação viral são tat e rev , os quais regulam a transcrição viral. Há ainda genes acessórios como nef, vpu,vpr e vif, os quais contribuem para capacitar a replicação viral. Vif aumenta a eficiência da infecção viral in vitro. Vpu toma parte no processo de montagem e Vpr transporta o genoma viral para o núcleo. Nef apresenta múltiplas funções, incluindo a aceleração da doença clínica, aumento da infectividade viral, modula sinal de transdução e favorece a entrada do vírus em células alvo que contenham CD4. Tat e Rev são proteínas reguladoras que se acumulam no núcleo e ligam-se a regiões definidas do ARN viral: o TAR (elemento de resposta à trans-ativação), encontra-se no LTR; e o RRE (elemento resposta rev), encontra-se no gene env, respectivamente. A proteína TAT é um potente ativador pós-transcricional da região promotora LTR e é essencial para a replicação viral na maioria dos sistemas de cultura in vitro. A ciclina T1 é um co-fator celular necessário para a TAT . A Tat e a  Rev estimulam a transcrição do ADN proviral de VIH-1 em ARN, promovem a elongação do ARN, estimulam o transporte de ARN de VIH-1 do núcleo para o citoplasma e são essenciais para a tradução. A Rev é também um fator nuclear de exportação importante na troca da expressão precoce das proteínas reguladoras  pelas proteínas estruturais que são sintetizadas mais tardiamente. Mostrou-se que a Nef tem várias funções. A Nef pode induzir a sub-regulação dos CD4 e das moléculas HLA de classe I e II a partir da superfície das células infectadas com VIH-1, o que pode representar um mecanismo de escape importante do vírus a um ataque imediato por células T CD8⁺ citotóxicas e para evitar reconhecimento pelas células T CD4⁺. A Nef pode também interferir com a ativação das células T por ligação a várias proteínas que estão envolvidas nas vias intracelulares de transdução de sinal. A Vpr parece ser essencial para a replicação viral em células como os macrófagos. A Vpr pode estimular o LTR juntamente com uma variedade de promotores virais e celulares. Mais recentemente, verificou-se que a Vpr é importante para o transporte do complexo de pré-integração viral para o núcleo e pode reter as células na fase G2 do ciclo celular. A Vpu é importante para o processo de formação de vesículas, uma vez que mutações no vpu estão associadas com a persistência das partículas virais na superfície da célula hospedeira. A Vpu é também envolvida quando os complexos CD4-gp160 são degradados no retículo endoplasmático e por isso permite a reciclagem da gp160 para a formação de novos viriões.

A Vif é importante para os mecanismos intracelulares de transporte dos componentes virais. Foi demonstrada a co-localização da vif juntamente com a  vimentina, uma proteína pertencente ao citoesqueleto celular. Os viriões deficientes em vif podem ser transmitidos célula a célula, mas não a partir de um meio livre de células. A Vif parece também afectar a morfogénese viral. Os LTRs regulam a expressão gênica viral e, portanto, replicação e patogênese.

Em resumo: Cerca de 11 genes codificam a síntese de proteínas estruturais e reguladoras :

• Gene env codifica a síntese das proteínas do envelope do vírus, ou seja, gp160, que se cinde posteriormente gerando gp120 e gp41.

• Gene gag, gene do antígeno do grupo, que codifica a síntese das proteínas da região central do vírus, ou seja, p55, que posteriormente se cinde em p24 e p17.

• Gene pol, que codifica enzimas que atuam na replicação viral, ou seja, p11, p32 e p51.

• Gene tat, responsável pela transativação de sinais recebidos pela célula infectada e passados ao genoma viral.

• Gene rev, responsável pela regulação da síntese de proteínas virais, isto é, regula a proporção de produção de proteínas reguladoras em relação às estruturais.

• Gene nef, regula negativamente a síntese de proteínas virais.

• Gene vif, conhecido como fator de virulência, sua presença parece estar associada à maior infectividade viral.

• Segmento LTRs, ou “Repetição Terminal Longa”, onde se situam várias proteínas reguladoras do ciclo biológico viral.

• Gene vpu, que codifica proteína de mesmo nome, e que tem como função degradar novos receptores CD4, que são formados pela célula infectada, e diminui a formação de proteínas de superfície celular da classe MHC I, que estão envolvidos no reconhecimento das células infectadas por linfócitos T citotóxicos.

• Genes vpx e vpr, cujas funções ainda não estão bem estabelecidas.

   

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DIAGNOSTICO

As técnicas mais freqüentemente utilizadas para pesquisa de anticorpos anti-HIV são: teste imunoenzimático (Enzyme Linked Immunosorbent Assay-ELISA), fluorimetria, quimioluminescência, radioimunoprecipitação (Radio Immunoprecitation Assay-RIPA), aglutinação de partículas de látex, imunofluorescência indireta (If) e Western-Blot (WB). O ELISA e o WB têm, atualmente, alta sensibilidade(99%). Em termos de diagnóstico sorológico de infecção pelo HIV, o Ministério da Saúde do Brasil preconiza que seja realizado o ELISA, em duplicata, como método de triagem, e um outro método como teste confirmatório de positividade, que pode ser a aglutinação de partículas de látex, ou a If, na dependência das condições do laboratório. Ao realizar-se o ELISA:

1 - caso o exame seja negativo, considera-se negativa a amostra;

2 - se o resultado for duvidoso ou indeterminado, deve-se repetir o procedimento em duplicata, e, persistindo a dúvida, proceder ao teste confirmatório

(If ou aglutinação do látex);

3 - se a amostra for positiva, realizar o teste confirmatório.

Realizando-se o teste confirmatório (If ou aglutinação do látex):

a) se positivo, repetir, em nova amostra, todo o procedimento;

b) se indeterminado ou negativo, realizar WB.

Em bancos de sangue, realiza-se, como método confirmatório, o WB em todas as amostras.

Protocolo para se liberar um resultado sorologico em diagnostico do HIV:

                                               www.aids.gov/diagnostico/documentos/notas.

BIBLIOGRAFIA

RUBBERT A, BEHRENS GAND OSTROWSKI M: Patogênese da Infecção pelo VIH-1 http://hivmedicine.aidsportugal.com/html/03_Pathophys.html acesso em 14/09/2011.

MACHADO AA & COSTA JC. Métodos laboratoriais para o diagnóstico da infecção pelo vírus da imunodeficiência

humana (HIV). Medicina, Ribeirão Preto, 32: 138-146, abr./jun. 1999.

DA SILVA BCM. Estudo de reconhecimento de epitopos das proteínas Gag e Nef do HIV dos linfócitos T em indivíduos  cronicamente infectados não progressores por longo tempo, 2008.

ALBUQUERQUE ACC, COSTA QS, PEREIRA JMA. Novos alvos terapêuticos virais no controle da infecção pelo HIV.

N CORDEIRO, R TOROCO temas de bacteriología y virología medica Retrovirus y HIV cap 26 pag. 446 a 476.

Santos, Norma Suely de Oliveira; Romanos, Maria Teresa Villela; Wigg, Márcia Dutra. Introdução à Virologia Humana. 2. ed. Rio de Janeiro 2008. cap. 14 págs. 415-416.

X Congresso Virtual HIV/AIDS: O VIH/SIDA nos paises de língua portuguesa. http://www.aidscongress.net/Home@1.aspx . Acesso em: 14 de agosto de 2011.

Fluxograma para detecção de anticorpos anti HIV em indivíduos com idades acima de 2 anos acesso em 20/09/2011 disponível em www.aids.gov/diagnostico/documentos/notas.